Transcrição e processamento do RNA: Pol II, capeamento 5′ e splicing do pré-mRNA
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A RNA polimerase II transcreve os genes codificadores de proteína e, segundo a revisão, fosforilações do seu domínio C-terminal ajudam a recrutar os fatores de processamento do RNA, a começar pelo capeamento 5′, a primeira modificação do transcrito.
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A RNA polimerase II transcreve os genes codificadores de proteína e, segundo a revisão, fosforilações do seu domínio C-terminal ajudam a recrutar os fatores de processamento do RNA, a começar pelo capeamento 5′, a primeira modificação do transcrito. O splicing remove os íntrons e une os éxons pelo spliceossomo, em duas reações de transesterificação, dirigido por sequências consenso (GU no sítio 5′, AG no sítio 3′, trato de polipirimidinas, ponto de ramificação) e por elementos reguladores com proteínas SR e hnRNP, o que também gera o splicing alternativo. Mutações que desfazem esses sinais causam doença; ficam de fora a poliadenilação, o spliceossomo menor, as terapias de splicing e outras omissões declaradas.
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Essential
- RNA polimerase II (Pol II): transcreve todos os genes codificadores de proteína e muitos RNAs não codificantes nos genomas eucarióticos. É uma enzima de 12 subunidades que, segundo a revisão, não consegue iniciar a transcrição nem transcrever de forma consistente sequências longas de DNA.
- Iniciação: nos eucariotos, a TBP regula a transcrição pela Pol II como componente do complexo TFIID.
- Pausa: DSIF e NELF ajudam a estabelecer a pausa da Pol II, um intermediário comum em metazoários, a cerca de 20 a 60 pb do sítio de início da transcrição. A pausa parece importante, entre outras funções, para garantir o capeamento 5′ adequado do RNA nascente.
- Domínio C-terminal (CTD): durante a iniciação, o CTD é fosforilado por cinases ligadas à transcrição (CDK7, a cinase do TFIIH, e CDK9, a cinase do P-TEFb). Essas marcas ajudam a dirigir a ligação de fatores de processamento do RNA (enzimas de capeamento, fatores de splicing e de terminação) quando a Pol II deixa a região proximal ao promotor e percorre o corpo do gene.
- Capeamento: a primeira modificação do RNA transcrito pela Pol II, co-transcricional no núcleo, logo que os primeiros nucleotídeos são incorporados ao transcrito nascente.
- Íntrons e éxons: os íntrons ocupam o restante do espaço do gene e separam éxons codificadores vizinhos. Os éxons precisam ser unidos após a excisão precisa dos íntrons: o splicing do pré-mRNA.
- Sinais: a maquinaria é dirigida por sequências consenso perto das fronteiras éxon-íntron, o sítio de splicing 5′, o sítio 3′ e a sequência do ponto de ramificação, a montante do sítio 3′. O sítio 5′ tem o dinucleotídeo GU no início do íntron, essencial ao splicing; o sítio 3′ tem um dinucleotídeo AG invariável na ponta 3′ do íntron e, a montante, o trato de polipirimidinas.
- Spliceossomo: complexo ribonucleoproteico grande que catalisa o splicing; monta-se de novo sobre cada íntron transcrito.
- Primeira transesterificação: o fosfato do sítio 5′ é atacado pela hidroxila 2′ do ponto de ramificação; a ponta 5′ do íntron se separa do éxon a montante e se liga ao ponto de ramificação por ligação fosfodiéster.
- Segunda transesterificação: ocorre no sítio 3′ do íntron; essa etapa libera o íntron (em laço, o lariat) e liga os dois éxons por ligação fosfodiéster.
- O capeamento colabora: segundo a revisão, a cap m7G é necessária ao splicing eficiente, por recrutar o complexo de ligação à cap (CBC) nuclear, que orquestra, entre outros processos, a montagem do spliceossomo.
In the clinic
- Variante nos dinucleotídeos do sítio de splicing 5′ ou 3′ (GU ou AG) · A mutação dos dinucleotídeos dos sítios 5′ e 3′ e das bases adjacentes pode torná-los inativos; segundo a revisão, é o mecanismo de interrupção do splicing mais facilmente reconhecido e responde por 10% de todas as mutações de doenças hereditárias humanas. · O GU no início do íntron é essencial ao splicing e o AG da ponta 3′ é invariável; sem o sinal, o spliceossomo não reconhece o limite.
- Variante pontual dentro de um éxon que desfaz um elemento regulador (ESE) ou cria um silenciador (ESS) · Todas as classes de mutações pontuais, inclusive as sem sentido, podem interromper elementos regulatórios exônicos de splicing e induzir splicing aberrante; segundo duas estimativas citadas pela revisão, 22 a 25% das mutações exônicas de doenças hereditárias humanas devem ser sensíveis ao splicing. · Os enhancers e os silenciadores atuam com proteínas ligadoras de RNA (as SR e as hnRNP); o éxon deixa de ser reconhecido ou passa a ser excluído do mRNA.
- Gene com muitos éxons, como o CFTR, na fibrose cística · Cerca de 13 a 20% das mutações associadas à fibrose cística são consideradas causadoras de defeitos de splicing do pré-mRNA, por inclusão ou exclusão anômala de éxons dos 27 do gene, como mecanismo primário da doença. · Num gene com muitos éxons há muitos limites éxon-íntron em que o sinal pode falhar; a ordem de grandeza vem da revisão, não é valor de referência.
- Proteína ligadora de RNA (RBP) mutada ou com expressão alterada · Segundo a revisão, as RBPs estão implicadas, por mutação ou por expressão aberrante, em numerosas doenças humanas. · Aqui o defeito está no fator que lê o sinal, não no sinal; o processamento de transcritos específicos, ou de famílias deles, pode ficar desregulado.
Test yourself before moving on
Que complexo catalisa o splicing do pré-mRNA, quantas reações sequenciais ele faz e quais são os dois produtos finais?
The answer stays in Assessment, with no spoiler here.
Answer in AssessmentSources (5)
- Schier AC, Taatjes DJ. Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription machinery. Genes Dev. 2020;34(7-8):465-488.
RNA polymerase II (Pol II) transcribes all protein-coding genes and many noncoding RNAs in eukaryotic genomes. Although Pol II is a complex, 12-subunit enzyme, it lacks the ability to initiate transcription and cannot consistently transcribe through long DNA sequences.
- Ramanathan A, Robb GB, Chan SH. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res. 2016;44(16):7511-7526.
Capping is the first modification made to RNA polymerase II-transcribed RNA and takes place co-transcriptionally in the nucleus as soon as the first 25–30 nts are incorporated into the nascent transcript
- Sterne-Weiler T, Sanford JR. Exon identity crisis: disease-causing mutations that disrupt the splicing code. Genome Biol. 2014;15(1):201.
Introns make up the rest of this gene space, separating adjacent protein coding exons from one another.
- Cieply B, Carstens RP. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2015;6(3):311-326.
The splicing machinery is directed by consensus sequences at or near the exon/intron boundaries; the 5′ splice site, the 3′ splice site, and the branchpoint sequence (BPS) that is located upstream of the 3′ splice site
- Jiang W, Chen L. Alternative splicing: Human disease and quantitative analysis from high-throughput sequencing. Comput Struct Biotechnol J. 2021;19:183-195.
During the first transesterification, the phosphate at the 5′ splice site is attacked by the 2′- hydroxyl group at the branch point which results in the 5′ end of the intron being cleaved from the upstream exon, and then joining to the branch point by a phosphodiester bond.
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